白皮杉醇（ＰＣＴ）是一种自然多酚化合物ManBetX万博体育官网在线登录，多数存在于葡萄、蓝莓及大黄等多教训物中。 当今计算已讲授，ＰＣＴ具备多种生物活性，包括开脱基捣毁、抗菌、扼制白血病及抗癌等特质 。 此外，ＰＣＴ具有较小的毒反作用，对东说念主体的潜在不良影响较低 。当今探讨ＰＣＴ在炎症调养中的文件较少，况且计算局限于细胞践诺阶段。 因此，需进一步计算来细目ＰＣＴ在动物模子中的炎症保护恶果。
形态生物斑马鱼成为评价炎症反应及药筛的新兴动物模子。 斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）是鲤形目鲤科丹尼亚属的一种热带鱼，成年鱼个体较小、容易饲养、生息力强、胚胎透明 。 由于其助长发育周期比啮齿动物短，诽谤了进行动物践诺需要的时分和资本 。 况且斑马鱼基因组与东说念主类基因有 ８７％ 的同源性 ，斑马鱼与东说念主体在药理药效上也有保守性。 此外，斑马鱼具有与哺乳动物相似的炎症反应机制 ，包括细胞因子的产生、炎症细胞的招募和炎症基因的抒发。 由于以上优点，斑马鱼成为恰当评价炎症药物的新兴形态生物 ，且比年来，斑马鱼已被粗鄙用于药物的炎症缓解筛选以及磋商安全性评价 。
本计算哄骗形态动物斑马鱼的炎症模子，评价 ＰＣＴ 的抗炎恶果，为后期斥地毒反作用小、资本低的小分子药物提供依据。
践诺顺次
ＰＣＴ 安全浓度的摸索： 最初需要对斑马鱼进行安全浓度摸索，通过前期想象树立如下 ７ 个组别： Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ。 首 先对 ２４ ｈｐｆ 斑马鱼进行收罗，对此时分段的斑马鱼进行如上述浓度给药，为期 ３ 天。 ３ 天后对上述料理斑马鱼进行明场拍照、荧光拍照，初步分析在不同 ＰＣＴ 浓度 下的斑马鱼表型是否荒谬，腹黑是否出现荒谬。
伸开剩余82%斑马鱼心率的统计与意想： 斑马鱼心率统计： 通过意想 １２ ｓ 内斑马鱼心跳次数，在此数量上乘５，即可赢得斑马鱼每分钟心跳次数。
中性粒细胞召募践诺： 铜是一种微量元素。 环境中过量的无机铜会破损斑马鱼体内的铜均衡，导 致氧 化 应 激 损 伤 介 导 的 炎 症 反 应 。 在 硫 酸 铜 （ＣｕＳＯ４ ）给药后，体内的中性粒细胞被激活，蚁集到发 生炎症的脊椎神经丘部位，可通过此部位的中性粒细 胞蚁集经由，反应炎症症状的轻重经由 。
践诺准备 ３ ｄｐｆ Ｔｇ（ｃｏｒｏ１ａ：ＧＦＰ；ｌｙｚ：Ｄｓｒｅｄ） 荧光斑 马鱼，并对其余 ７ 个组进行 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ ，ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 料理 ２ ｈ。 ２ ｈ 后，将 上述药液换成 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ ，再进行 ３０ ｍｉｎ 显现， 后续使用显微镜对斑马鱼脊椎神经丘部位进行荧光拍 照，使用 ＩｍａｇｅＪ 对此部位荧显豁红色的中性粒细胞进行收罗。
ｑＰＣＲ 考证炎症磋商基因的抒发： 斑马鱼总 ＲＮＡ 提真金不怕火：对 ３ ｄｐｆ 的 ＷＴ 斑马鱼进行如下给药料理 １ ｈ：ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ。 后 续对上述浓度斑马鱼及 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组斑马鱼（另外留一组 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组不进行任何泡药料理）进行 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ 炎症 造 模 ２４ ｈ。 次 日 将 以 上 胚 胎 转 移 至 ２ ｍＬ ＲＮａｓｅＦｒｅｅ 离心管中，每管２０ 条，每组３ 个生物学重叠， 每管加入 ３００ μＬ ＲＮＡ 裂解液及数颗小磁珠，放至匀浆 仪上飘零裂解胚胎。 尔后按照 ＥａｓｔｅｐＳｕｐｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ 身手对胚胎裂解物进行总 ＲＮＡ 提真金不怕火，使用
Ｎａｎｏｄｒｏｐ 测浓度，临了将样品的 ＲＮＡ 保存在 － ８０℃ 。
回转录 ｃＤＮＡ：使用 ＴａＫａＲａ 公司的回转录试剂盒 将提真金不怕火的 ＲＮＡ 回转录为 ｃＤＮＡ。
ｑＰＣＲ 践诺：使用了 ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ 引物想象网 站想象的荧光定量 ＰＣＲ 引物，其长度在 １００ ～ ２００ ｂｐ。 每个反应均树立 ３ 个时刻重叠，并以回转录的 ｃＤＮＡ 为 模板稀释后进行扩增。 β⁃ａｃｔｉｎ 用于圭臬化参照，以调动样本之间的各异。
接纳 ２ － ΔΔＣｔ 进行数据收罗。 所额外据均经 Ｔｕｋｅｙ 独身分方差分析（ ｏｎｅ⁃ｗａｙ ＡＮＯＶＡ） 及 Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ 检会， 统计学权贵性各异界说为 Ｐ ＜ ０． ０５。 使用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ 软件制图（表 1 为 ｑＰＣＲ 引物序列）。
表 1 ｑＰＣＲ 的引物序列
本计算最初开展 ＰＣＴ 安全使用浓度的摸索践诺，为后续炎症践诺奠定基础。 咱们对诞生后 ２４ ｈ 的斑马鱼胚胎进行 ＰＣＴ 泡药 ３ 天的料理，树立浓度进行显微镜明场拍照及荧光拍照，每 组 ３０ 个胚胎，树立 ３ 个生物重叠。 泡药鱼系为心室红 色荧光、心房绿色荧光特异性符号的鱼系 Ｔｇ （ ｖｍｈｃ： ｍＣｈｅｒｒｙ⁃ＮＴＲ； ａｍｈｃ：ＥＧＦＰ），明场下，可见斑马鱼腹黑发育无各异，并无心包腔水肿等荒谬出现，在荧显豁微 镜下进行不雅察，腹黑与 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组比较，环化平素，泵跳有劲，无任何不良表型（图 Ａ）。 当 ＰＣＴ 浓度梯度从 １ μｍｏｌ ／ Ｌ 提升至 １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 时，与对照组比较，斑马鱼 心跳次数无权贵各异，均在平素数值边界内（图 Ｄ）。
随后，咱们对斑马鱼进行行动学践诺，行动学测试 在斑马鱼进行药物显现料理的第 ６ 天进行，此时鱼较为活跃。 行动轨迹和相应的热图如图 Ｂ、Ｃ 所示。 树立浓度进行梯度浓度践诺，每个浓度进行６次生物学重叠。 后续收罗斑马鱼游动距离，并进行各异性分析（图 Ｅ）。 戒指标明，在所树立梯度边界内，与 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组比较，该浓度梯度组不会对斑马鱼行动酿成影响。 据此可得出论断，在ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ及 ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 边界内，ＰＣＴ 不会对斑 马鱼酿成任何影响，故可在该浓度边界内进行后续践诺。
白细胞介素⁃６（ＩＬ⁃６）是一种多功能细胞因子，由多种细胞（包括淋巴细胞、单核巨噬细胞等）产生，粗鄙参与免疫和炎症反应的调整 ，在炎症发生时，ＩＬ⁃６ 水平会高潮。 环氧合酶２（ＣＯＸ⁃２）是一种率领酶，在细胞受到炎症刺激时抒发量加多，血液中肿瘤坏死因子⁃α（ＴＮＦ⁃α） 基因抒发水平的升高一样标明炎症反应的存在。 在 ＣｕＳＯ４ 刺激后，斑马鱼体内 ＩＬ⁃６、ＣＯＸ⁃２ 及ＴＮＦ⁃α 抒发水平权贵上调，其中 ＩＬ⁃６ 基因的抒发量高潮 ２ 倍， ＣＯＸ⁃２ 及 ＴＮＦ⁃α 的抒发量高潮较高，比较于对照组而言，抒发量均高潮 ７ 倍。 与 ＣｕＳＯ４ 单独料理组比较， ＰＣＴ 料理 ２４ ｈ 后，ＩＬ⁃６、ＣＯＸ⁃２ 及 ＴＮＦ⁃α 的抒发水平下 调（图1）。
图 1 ＣｕＳＯ４刺激及 ＰＣＴ 料理后斑马鱼幼体炎症磋商基因 ｑＰＣＲ 践诺
本计算发现 ＰＣＴ 对斑马鱼炎症具有缓解作用，在斑马鱼衍生液中加入化合物 ＣｕＳＯ４ 可建设细胞毁伤及 氧化应激的斑马鱼炎症模子，在该炎症模子中，中性粒细胞在脊椎神经丘中的积聚是最常用的炎症水平认识之一，该认识已被粗鄙用于评估抗炎药物恶果 。 ＲＯＳ 不错径直激活细胞内的炎症信号通路，如核因子⁃ κＢ （ ＮＦ⁃κＢ ） 和 促 分 裂 原 活 化 的 蛋 白 质 激 酶 （ＭＡＰＫ） ，这些信号通路的激活导致炎症细胞因子的抒发加多，从而促进炎症反应，这发达为 ＲＯＳ 水平高潮和中性粒细胞向脊椎神经丘的趋化。
有文件报说念 ＰＣＴ 不错促进抗氧化核转录因子红系２磋商因子 ２ （Ｎｒｆ２）的核易位和靶基因转录，从而诽谤细胞内 ＲＯＳ 水平 。 ＰＣＴ 可通过扼制 ＮＦ⁃κＢ 通路阐发抗炎作用 ，且扼制 ｐ６５ 的核易位及促炎细胞因 子分泌，包括 ＩＬ⁃６、ＴＮＦ⁃α 和 ＩＬ⁃８ 。
论断：
咱们的计算戒指强化了ＰＣＴ 通过抗氧化门道缩小 炎症毁伤的表面。 格外是 ＰＣＴ 对 ＲＯＳ 水平的诽谤作用，这小数在扼制炎症细胞因子抒发的践诺中赢得了阐述。 这些发现不仅提拔 ＰＣＴ 当作潜在抗炎调养药物的长进，也为联结炎症性疾病的分子机制提供了新视角。 改日的计算不错鸠合在以下几个标的：可进一步深远计算 ＰＣＴ 在体内的继承、诀别、代谢特质，以优化其当作药物的剂量和给药频率。 此外可通过评估 ＰＣＴ 遥远应用的安全性，确保其当作调养药物的可行性，以 及计算 ＰＣＴ 与其他抗炎药物的协同效应，探索转圜治 疗的可能性。 说七说八，ＰＣＴ 可扼制炎症反应，为 ＰＣＴ 当作潜在抗炎调养药物提供了有劲左证。
参考文件：
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